Гистологическая проводка на изопропиловом спирте

Содержание
  1. Судебно-медицинская гистология
  2. Проводка в изопропаноле
  3. Метод обезвоживания и заливки гистологического материала в парафин и окраска срезов с применением изопропилового спирта
  4. похожие статьи
  5. Проводка изопропанол-парафин. Ручной и автоматический методы
  6. Проводка изопропанол-парафин
  7. Варианты проводки на изопропанол-парафине
  8. Эндоскопические биоптаты. Ручной метод
  9. Хирургические образцы. Ручной метод
  10. Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 1 корзина, 2 парафина
  11. Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 1 корзина, 3 парафина
  12. Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 2 корзины, 2 парафина
  13. Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 2 корзины, 3 парафина
  14. Хирургические образцы. Карусельный процессор. 1 корзина, 2 парафина
  15. Хирургические образцы. Карусельный процессор. 1 корзина, 3 парафина
  16. Хирургические образцы. Карусельный процессор. 2 корзины, 2 парафина
  17. Хирургические образцы. Карусельный процессор. 2 корзины, 3 парафина
  18. Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям

Судебно-медицинская гистология

Блог судебно-медицинских гистологов Северо-Западного Федерального округа

Проводка в изопропаноле

Проводка приспособлена нами к карусельному процессору фирмы Leica ТР1020, которым мы с удовольствием пользуемся уже несколько лет. Возможно, можно и на других или вручную.

Станция Реагент Экспозиция
1 50%-ный водный раствор изопропилового спирта 1 час.
2 Абсолютированный изопропанол 30 мин.
3 Абсолютированный изопропанол 30 мин.
4 Абсолютированный изопропанол 30 мин.
5 Абсолютированный изопропанол 1 час.
6 Абсолютированный изопропанол 1 час.
7 Абсолютированный изопропанол 2 час.
8 Абсолютированный изопропанол 3 час.
9 Абсолютированный изопропанол 3 час.
10 Парафин 1 час.
11 Парафин 3 час.
12 Парафин 4 час.
Итого 20 час.30 мин.

Примечание: использовать только абсолютированный 99,7° и выше изопропанол.

Также хорош (даже несколько лучше) химически чистый изопропанол (ХЧ). Другие не годятся, снижение градусности резко — катастрофически снижает качество препаратов. Никаких добавок к спирту мы не применяли.

Данный вариант проводки позволяет провести в течение суток в 1-ной корзине до 400 (!) кусочков органов (секционный материал — т.е. крупных по площади, но толщиной до 3 мм — !). Вакуумник включать не требуется. В этом варианте проводки легко применима (при необходимости) двойная загрузка, но это увеличивает время, т.к. в парафинах материал должен находиться не менее 8 часов, причем не менее 3,5 часов в чистых, следовательно на каждой станции — по 3,5 часа. Т.о. вся проводка — почти 2 дня.

Биопсии проходят быстрее.

Увеличение времени пребывания в спиртах свыше указанного не улучшает и не ухудшает качества препаратов. Критично время пребывания в парафине — его уменьшение существенно ухудшает пропитывание кусочков и средина вываливается. Это время при возможности можно увеличивать.

При замене спиртов — на 1 шаг назад. Одновременно заменяется 50% изопропанол (смесь с водой готовится из чистого спирта !). Менять — по мере загрязнения. Но после проводки более 300 кусочков — обязательно.

Мы использовали биовитрумовский Histomix.

Данная проводка по качеству выше ксилольной и ацетоновой, почти аналогичная хлороформенной, но имеется существенная экономия на реагентах, так как исключается промежуточная среда.

Не надо бояться напрямую опускать кусочки из изопропанола в парафин(!), также как из хлороформа или ксилола, минуя «каши».

Источник

Метод обезвоживания и заливки гистологического материала в парафин и окраска срезов с применением изопропилового спирта

библиографическое описание:
Метод обезвоживания и заливки гистологического материала в парафин и окраска срезов с применением изопропилового спирта / Печкуренко А.Л., Куликов И.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 1998. — №1. — С. 69-70.

код для вставки на форум:

По классической схеме обработки материала для гистологического исследования после одно — двух суточной фиксации кусочков в фиксирующей жидкости происходит обезвоживание их с помощью этилового спирта. Для этого кусочки помещают в этиловый спирт в возрастающей концентрации от 70% до 96% обычно по очереди, в 3-4 широкогорлых банках по 6-24 часа в каждой порции. После этого кусочки помещают на 1-3 часа в ксилол или другой растворитель, затем на 2-3 часа в расплавленный парафин.

В лучшем случае, при наличии автомата для гистологической обработки ткани, такая методика позволяет обработать материал за 3-5 суток.

Существуют ускоренные методы заливки материала в парафин с применением ацетона, сокращение количества банок спиртов для обезжиривания. Однако эти методы страдают рядом недостатков. В частности, ацетон требует применения маленьких кусочков размером 2-3 мм и очень сильно деформирует ткани; сокращенная длительность пребывания кусочков в спиртах улучшает качество диффузии парафина в них, что сказывается при резке проведенного материала на микротоме.

Нами был опробован в качестве заменителя этилового спирта концентрированный изопропиловый спирт, как технический, так и химически чистый.

Острой опасной бритвой аккуратно вырезанные из фиксированного материала кусочки, в виде тонких пластинок, толщиной 2-4 мм и площадью

1-2 см, промытые и слегка просушенные на фильтрованной бумаге, помещают в 4 порции изопропилового спирта на 1 час в каждую порцию; после этого кусочки переносят на 1 час в один из растворителей и переносят в расплавленный, нагретый в термостате до 57 С 0 парафин, 2 порции по 1 часу в каждой. Общая длительность обработки материала составляет 7 часов. При необходимости лаборант успевает в течении рабочего дня залить материал в парафин, порезать и покрасить его, а врач — исследовать под микроскопом.

Нами так же опробована методика исключения из проводки исследуемого материала сильно ядовитых веществ, таких как ксилол, толуол, бензол. Изопропиловый спирт легко смешивается с расплавленным парафином и это позволяет переносить материал непосредственно из изопропилового спирта в расплавленный парафин, не меняя времени экспозиции.

Характерным является то, что обрабатываемые кусочки становятся весьма пластичными, что позволяет делать серийные срезы толщиной 3-4 микрона каждый. Нам удавалось получить гистологический срез цельной почки новорожденного, прокрасить его, заключить в полистирол; при применении обычных методов подобных результатов добиться невозможно.

Изопропиловый спирт не является сильно действующим ядовитым веществом и более вредного влияния, чем этиловый спирт, на организм работающего с ним не оказывает.

Срезы тканей после проводки с применением изопропилового спирта хорошо воспринимают стандартные методы окраски, такие как гемотаксилин-эозин, окраску по методу Ван-Гизон.

В процессе окраски материала можно исключить применение этилового спирта, заменив его изопропиловым, не меняя времени экспозиции срезов в спирте и порядка окраски материала.

Данный метод, благодаря резкому увеличению скорости обработки материала, может быть применен для работы в гистологических отделениях.

похожие статьи

Атлас по судебно-медицинской гистологии / Пиголкин Ю.И., Кислов М.А., Должанский О.В., Филиппенкова Е.И., Крупин К.Н. — 2021.

Анализ недостатков судебно-гистологических исследований и пути их устранения / Гедыгушева Н.П., Буланова Э.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 47-49.

Возможности установления некоторых причин смерти гистохимическими методами / Смирнов В.В., Смирнов В.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 31-32.

Актуальные вопросы гистологического исследования при экспертизе живых лиц / Кулеша Н.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018. — №17. — С. 125-128.

Источник

Проводка изопропанол-парафин. Ручной и автоматический методы

Здравствуйте, коллеги!
С вами просветляющая рубрика «Образователь»

Часто те, кто используют изопропанол в проводке, задают вопрос: может ли дегидратант (изопропанол) заменить промежуточную среду, или просветлитель (ксилол, толуол, масло и т.д.)?
Отвечаем: не может. Функции у дегидратанта и просветлителя разные, а выполняют их вещества из совершенно разных химических классов. Промежуточная среда нужна не только для осуществления перехода между спиртом и парафином, основная её роль — просветление тканей, то есть подготовка их к пропитыванию парафином. Если ткани непросветлённые, они хуже пропитываются парафином, и возникают проблемы при резке. Особенно это заметно на жировой ткани.

Это интересно:  Мотокультиватор тарпан регулировка карбюратора

Тем не менее, в некоторых лабораториях существует проводка изопропанол-парафин, и в этой статье мы приведём примеры такой проводки.

Проводка изопропанол-парафин

Большинство деликатных тканей удается провести таким способом и получить вполне пригодные для диагностики препараты. Это эндоскопические биоптаты, лимфоузлы, гинекологические соскобы, фрагменты слизистых оболочек, эмбрионы ранних сроков. Однако, очень часто получаются неудовлетворительные результаты для традиционно «трудных тканей», таких как жир, кишка, матка, кожа, опухоли из мышечной и соединительной ткани, кости. Поэтому прежде, чем запускать такой протокол в рутинную работу, проверьте, будет ли в ваших условиях достижим желаемый результат.

Изопропанол, в отличие от этанола, смешивается с парафином, поэтому многие считают, что промежуточная среда не нужна. Способность изопропанола смешиваться с расплавленным парафином известна благодаря тому, что при температуре выше 25оС он может находиться в области неполярных жидкостей, и благодаря этому хорошо смешивается с расплавленным парафином. Но здесь важно знать, что изопропанол никак не заменяет ксилол или любой другой просветлитель. Изопропанол удаляет из тканей воду, денатурирует большинство белков и растворяет большую часть жиров, но не просветляет ткани, так как его коэффициент преломления далек от ксилола и его аналогов.

Имеется два способа удаления изопропанола из тканей:
1. Увеличение температуры выше 65, вплоть до 82оС, выше начинается выкипание и испарение его из тканей и парафина, но такая температура ведёт к необратимому повреждению тканей.
2. Увеличение времени в расплавленном парафине. При таком способе удлиняется протокол проводки и время действия горячего парафина, что переуплотняет ткани.

Изопропанол на рынке зачастую продается под разными торговыми названиями. Торговые марки очень часто содержат более 96% изопропанола и малую часть различных добавок (неоинные ПАВ, метанол, высшие спирты), которые практически не влияют на качество проводки.

Варианты проводки на изопропанол-парафине

Эндоскопические биоптаты. Ручной метод

  1. Изопропанол 30 мин
    2. Изопропанол 30 мин
    3. Изопропанол 30 мин
    4. Парафин 30 мин
    5. Парафин 30 мин
    6. Парафин 30 мин

Хирургические образцы. Ручной метод

  1. Изопропанол 2 часа
    2. Изопропанол 2 часа
    3. Изопропанол 2 часа
    4. Изопропанол 2 часа
    5. Изопропанол 16 час (ночь или выходные)
    6. Парафин 2 часа
    7. Парафин 2 часа
    8. Парафин 2 часа

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 1 корзина, 2 парафина

  1. Изопропанол 15 мин
    2. Изопропанол 15 мин
    3. Изопропанол 15 мин
    4. Изопропанол 15 мин
    5. Изопропанол 15 мин
    6. Парафин 1 час
    7. Парафин 1 час

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 1 корзина, 3 парафина

  1. Изопропанол 15 мин
    2. Изопропанол 15 мин
    3. Изопропанол 15 мин
    4. Изопропанол 15 мин
    5. Изопропанол 15 мин
    6. Парафин 30 мин
    7. Парафин 1 час
    8. Парафин 1 час

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 2 корзины, 2 парафина

  1. Изопропанол 15 мин
    2. Изопропанол 15 мин
    3. Изопропанол 15 мин
    4. Изопропанол 15 мин
    5. Изопропанол 15 мин
    6. Парафин 1 час
    7. Парафин 1 час (вторую корзину необходимо задержать дополнительно в парафине на 1 час)

Эндоскопические биоптаты. Карусельный процессор. 2 корзины, 3 парафина

  1. Изопропанол 15 мин
    2. Изопропанол 15 мин
    3. Изопропанол 15 мин
    4. Изопропанол 15 мин
    5. Изопропанол 15 мин
    6. Парафин 30 мин
    7. Парафин 1 час
    8. Парафин 1 час (вторую корзину необходимо держать дополнительно в парафине в течение 1 часа)

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 1 корзина, 2 парафина

  1. Изопропанол 2 час
    2. Изопропанол 2 час
    3. Изопропанол 2 час
    4. Изопропанол 2 час
    5. Изопропанол 2 час
    6. Парафин 3 часа
    7. Парафин 3 часа

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 1 корзина, 3 парафина

  1. Изопропанол 2 час
    2. Изопропанол 2 час
    3. Изопропанол 2 час
    4. Изопропанол 2 час
    5. Изопропанол 2 час
    6. Парафин 2 часа
    7. Парафин 2 часа
    8. Парафин 2 часа

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 2 корзины, 2 парафина

  1. Изопропанол 2 час
    2. Изопропанол 2 час
    3. Изопропанол 2 час
    4. Изопропанол 2 час
    5. Изопропанол 2 час
    6. Парафин 3 часа
    7. Парафин 3 часа
    Вторую партию перед заливкой необходимо выдержать 3 часа во втором парафине.

Хирургические образцы. Карусельный процессор. 2 корзины, 3 парафина

  1. Изопропанол 2 час
    2. Изопропанол 2 час
    3. Изопропанол 2 час
    4. Изопропанол 2 час
    5. Изопропанол 2 час
    6. Парафин 2 часа
    7. Парафин 2 часа
    8. Парафин 2 часа

Вторую партию перед заливкой необходимо выдержать 2 часа в третьем парафине.

Источник

Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям

Владельцы патента RU 2499242:

Изобретение относится к получению и подготовке образцов для исследования и может быть использовано при гистологических исследованиях биологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии. Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, при котором последовательно обрабатывают образцы биологической ткани раствором фиксатора, в качестве которого используют 10% раствор формалина, забуференного фосфатами натрия, обработку в промежуточных смесях ведут при комнатной температуре. Затем образцы биологических тканей промывают в воде. Дегидратацию проводят в нескольких порциях изопропанола. Просветление осуществляют в двух порциях промежуточных смесей, содержащих изопропанол и минеральное масло, при этом первая порция промежуточной смеси содержит пять частей изопропанола и одну часть минерального масла, а вторая порция содержит две части изопропанола и одну часть минерального масла. После обработки в промежуточных смесях образцы биологических тканей для просветления погружают в минеральное масло. Образцы биологических тканей пропитывают расплавленным парафином, в который добавляют 5% пчелиного воска, 0.8% диметилсульфоксида и 0,5% бутилкаучука. Техническим результатом изобретения является уменьшение трудозатрат и времени получения качественных срезов для гистологических исследований при любом уровне оснащения лабораторий: при ручной проводке, автоматической, в гистопроцессорах любого типа за счет подготовки образцов биологических тканей высокого качества. 5 з.п. ф-лы.

Предлагаемое изобретение относится к получению и подготовке образцов для исследования в медицине и может быть использовано при гистологических исследованиях биологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии.

Подготовка тканей к гистологическим исследованиям, как правило, включает пропитывание образца парафином, необходимое для получения срезов, с толщиной, пригодной для исследования в световом микроскопе при проходящем свете. Парафиновый срез размещают на предметном стекле, окрашивают и исследуют под микроскопом. Пропитывание биологических тканей парафином требует предварительного обезвоживания, так как содержащие воду ткани не пропитываются парафином. Поэтому перед пропитыванием парафином образцы необходимо:

1) сохранить в состоянии максимально приближенном к жизни и для этого остановить процессы аутолиза — зафиксировать;

2) удалить несвязанную воду из тканей — обезводить;

3) подготовить ткань к пропитыванию парафином — просветлить.

За аналог заявляемого изобретения приняты технические решения того же назначения, что и заявляемый способ. Известен способ обработки гистологических и биологических образцов путем последовательных погружений образцов в водный раствор фиксирующего вещества, обезвоживания в 6 сменах обезвоживающей жидкости, последние три из которых практически не содержат воды (Р. Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. — М.: Мир, 1969, с.69). В качестве фиксирующего вещества в известном способе используют 4%-ный водный раствор формальдегида, а в качестве обезвоживающих жидкостей этиловый или изопропиловый спирты, или их смеси. Образцы последовательно выдерживают в трех порциях обезвоживающей жидкости, содержащей воду: 70% этилового спирта в течение 16 часов, 85% этилового спирта в течение 8 часов, 95% этилового спирта в течение 16 часов, а затем в-безводных жидкостей: 100% этилового спирта в течение 2 часов. Смесь 100% этилового спирта и растворителя парафина (бензола) в соотношении 1:1 в течение 1 часа является промежуточной смесью, в которой одновременно завершается обезвоживание и начинается просветление. Далее обработка проводится в двух порциях бензола по 30 минут. А затем осуществляют (пропитывание парафином в нескольких сменах парафина). В качестве растворителя парафина кроме бензола можно использовать толуол, ксилол, петролейный эфир, сероуглерод, хлороформ и четыреххлористый углерод. Кроме очень большой длительности обезвоживания недостатком этого способа является то, что все используемые в нем растворители парафина — вредные вещества, и их вредность имеет кумулятивный характер.

Это интересно:  Ниссан альмера классик 2006 предохранитель на дальний свет

Известен способ обработки операционно-биопсийного и секционного материала для микроскопического исследования по патенту РФ на изобретение №2264608 (МПК G01N 1/28, G01N 1/30, заявлено 26.01.2004 г., опубликовано 20.11.2005 г.), в соответствии с которым проводку по растворам тканей производят на аппарате АТ-4 (автомат универсальный для гистологической обработки и окраски тканей). Фиксацию проводят 20% формалином при температуре 36°С в течение 2 часов, промывают проточной водой 4 часа, затем обезвоживают в пяти емкостях со спиртом концентрации 96% (в первой емкости 5 часов, во второй, третьей и четвертой емкостях по 3 часа, в пятой — 5 часов). Дубят в промежуточной смеси — спиртово-ксилоловом растворе 1 час и в ксилоле 1 час, затем заливают парафином при температуре 36°С на 1 час и при температуре 56°С также на 1 час. Недостатком этого способа также является неадекватная фиксация формалином: в подобной концентрации наступает избыточное образование перекрестных связей между молекулами белков тканей в поверхностной зоне образца, что препятствует равномерной фиксации образца, большая длительность обезвоживания, а также высокая токсичность ксилола, создающая экологическую опасность окружающей среды. Ксилол является нейро- и гепатоксичным ядом, вызывает патологию сердца и почек, лейкемию, оказывает токсическое воздействие на костный мозг и другие вредные воздействия на жизнедеятельность человека [Buesa RJ, Peshkov MV. Histology without xylene. Annals of diagnostic pathology, 2009. Vol.12(4), p.246-256].

Известен способ подготовки биологических образцов к гистологическим исследованиям, включающий обезвоживание образца в изопропиловом спирте и последующее парафинирование (заявка на изобретение РФ №94036621, заявлено 26.09.1994 г., опубликовано 10.07.1996 г.). Образцы тканей фиксируют в 4% растворе формальдегида в фосфатном буфере в течение 24 часов, отмывают проточной водой в течение 30 минут. Для обезвоживания образцы тканей последовательно выдерживают в 4-х сменах 99% изопропилового спирта по 3 часа в каждой смене. Для сохранения тканевых и клеточных структур образцов в изопропиловый спирт вводят поверхностно-активное вещество (ПАВ) в количестве 0,01-0,5 массовых частей. Обезвоженные образцы пропитывают парафином выдержкой в двух сменах расплавленного парафина по 2 часа. Недостатком этого способа является трудное удаление из тканей изопропанола при пропитывании горячим парафином. Высокий градиент параметров растворимости (9 МПа) подтверждает это. Но дегидратанты должны быть полностью удалены из парафина, что достигается увеличением температуры при низком давлении перед пропитыванием парафином

Наиболее близким аналогом того же назначения, что и заявляемое изобретение, является техническое решение — способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, включающий последовательную обработку образцов биологической ткани раствором фиксатора, промывку в воде, дегидратацию в нескольких порциях изопропанола, просветление в двух порциях промежуточных смесей, содержащих изопропанол и минеральное масло, просветление в минеральном масле, пропитывание и заливку образцов парафином [Buesa RJ, Peshkov MV. Histology without xylene. Annals of diagnostic pathology, 2009. Vol.12(4), p.246-256]. В известном способе дегидратацию осуществляют путем последовательного погружения образцов в четыре емкости с изопропанолом (на 1 час в каждую), и в две емкости с подогретыми до 50°С промежуточными смесями, содержащими изопропанол и минеральное масло (на 1,5 часа в каждую), причем промежуточная смесь в первой емкости имеет соотношение ингредиентов 5:1, а во второй — 2:1. Затем образцы выдерживают в просветлителе — минеральном масле в течение не менее 2 часов, после чего осуществляют пропитывание парафином при температуре 60°С в четырех емкостях по 1 часу в каждой.

К недостаткам известных технических решений, как аналога, так и прототипа, относится то, что при их реализации не исключены повторные окрашивания образцов биологических тканей, что увеличивает трудозатраты и время получения качественных срезов для гистологических исследований, и/или все они используют экологически вредные ксилол или спиртово-ксилоловые растворы.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является экономия трудозатрат и времени получения качественных срезов для гистологических исследований при любом уровне оснащения лабораторий: при ручной проводке, автоматической, в гистопроцессорах любого типа. Кроме того, задачей изобретения является улучшение экологических условий в гистологических лабораториях и во внешней среде.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в исключении последующей повторной окраске препаратов клеток и использовании безопасных для персонала и окружающей среды реактивов, исключая пагубное действие ксилола и других вредных веществ при последовательной проводке образцов биологических тканей.

Сущность способа подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, включающего последовательную обработку образцов биологической ткани раствором фиксатора, промывку в воде, дегидратацию в нескольких порциях изопропанола, просветление в двух порциях промежуточных смесей, содержащих изопропанол и минеральное масло, просветление в минеральном масле, пропитывание и заливку образцов парафином, состоит в том, что в качестве фиксатора используют 10% раствор формалина, забуференного фосфатами натрия, обработку в промежуточных смесях ведут при комнатной температуре при этом первая порция промежуточной смеси содержит пять частей изопропанола и одну часть минерального масла, а вторая порция содержит две части изопропанола и одну часть минерального масла, образцы биологических тканей пропитывают расплавленным парафином, в который добавляют 5% пчелиного воска, 0.8% диметилсульфоксида и 0,5% бутилкаучука.

Решению поставленной задачи способствует признаки, характеризующие изобретение в частных случаях ее выполнения или использования.

В фиксатор для эндоскопических образцов добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован эозин.

В фиксатор для хирургических образцов добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован метиленовый синий.

В изопропанол и промежуточные смеси добавляют поверхностно-активное вещество, в качестве которого использован Triton X 15.

Образцы биологических тканей выдерживают в минеральном масле в качестве просветлителя по меньшей мере 2 часа.

Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в течение 4 часов, при этом в двух емкостях по 2 часа или в 4 емкостях по 1 часу.

Из уровня техники неизвестно техническое решение с заявляемой совокупностью существенных признаков независимых пунктов формулы изобретения, что подтверждает ее соответствие условию патентоспособности — новизна.

Существенные отличительные признаки независимого пункта формулы заявляемого изобретения для специалиста явным образом не следуют из уровня техники, что подтверждает соответствие изобретения условию патентоспособности — изобретательский уровень.

Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям может быть осуществлен с реализацией указанного назначения следующим образом. Для подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям полученный материал фиксируют в забуференном нейтральном 10% растворе формалина (рН 7,0) в течение 24 часа при комнатной температуре или 18 часов при подогреве до 37°С. Соотношение объемов фиксатора и ткани не менее 20:1. Для забуферивания формалина используют одно- и двузамещенный фосфаты натрия в количествах, обеспечивающих рН конечного раствора на уровне 6.8-7.4. Полный рецепт нейтрального забуференного формалина: 6.5 г Na2HPO4 б/в и 4 г NaH2PO4×Н2О, 900 мл дистиллированной воды, 100 мл 37% формалина). К формалину добавляют цветовую метку: для эндоскопических образцов — эозин, для хирургических образцов — метиленовый синий, а также парфюмерную метку. В фиксатор для эндоскопических образцов биологических тканей добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован эозин. В фиксатор для хирургических образцов биологических тканей добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован метиленовый синий.

Это интересно:  Максимальная длина биметаллических радиаторов

После фиксации в формалине образцов биологических тканей промывают в проточной воде 15-20 минут для удаления избытка фиксатора, поскольку осадки фосфатов, образующиеся при действии спирта, загрязняют трубопроводы, стенки рабочей камеры и поворотного клапана гистопрцессора, а также осложняют работу на микротоме при получении срезов.

Далее проводят дегидратацию образцов биологических тканей, путем последовательного их погружения образцов в обезвоживающие жидкости, первая порция содержит не более 30% воды, а затем в обезвоживающие жидкости, не содержащие воды. В качестве обезвоживающей жидкости используют изопропанол, являющийся мягким дегидратантом, не уплотняющим и не дубящим ткани. Для облегчения пропитывания тканей в него добавляют поверхностно-активное вещество, в качестве которого использован Triton X15.

Для последующего просветления образцов биологических тканей в промежуточных смесях, в качестве которых используют смеси изопропанола и минерального масла в определенных соотношениях. Промежуточная смесь I содержит 5 частей изопропанола и 1 часть минерального масла, а промежуточная смесь II содержит 2 части изопропанола и 1 часть минерального масла. Промежуточные смеси стабильны, однородны и прозрачны при комнатной температуре и используются без нагревания при комнатной температуре благодаря наличию в их составе поверхностно-активного вещества марки Triton X 15, в них может быть добавлена парфюмерная метка. После обработки в промежуточных смесях образцы биологических тканей для просветления погружают в минеральное масло. Минеральное масло — это смесь насыщенных углеводородов, жидкая при комнатной температуре. Время воздействия минерального масла не менее 2 часов. Также образцы биологических тканей без любых неблагоприятных воздействий можно оставить в минеральном масле на любой необходимый срок: на несколько дней или до нескольких месяцев.

После этого образцы биологических тканей пропитывают расплавленным парафином с точкой плавления 52°-56°C с добавкой 5% пчелиного воска, 0.8% димтелисульфоксида, облегчающего пропитывание образцов биологических тканей, и 0,5% бутилкаучука, обеспечивающего большую их пластичность. Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в течение 4 часов, при этом в двух емкостях по 2 часа или в 4 емкостях по 1 часу.

Длительность проводки образцов биологических тканей по растворам определяется видом образцов и их размерами. Образцы, имеющие размеры 0.1×0.1×0.1 см проводятся по расписанию для эндоскопических образцов, а большие — по расписанию для обычных хирургических образцов.

Для хирургических образцов фиксацию осуществляют вышеописанным способом. Дегидратацию осуществляют последовательным погружением в пять емкостей с изопропанолом с выдержкой в каждой по 1 часу. Для просветления их последовательно погружают в две емкости с промежуточными смесями в каждую на 1,5 часа, а затем — в минеральное масло не менее 1,5 часов. Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в течение 4 часов (в двух емкостях по 2 часа или в 4 емкостях по 1 часу). Общее время проводки без учета фиксации 13,5 часов.

Фиксацию эндоскопических образцов размерами до 0.1×0.1×0.1 см осуществляют также как и хирургических образцов. Дегидратацию осуществляют последовательным погружением в две смены раствора изопропанола с выдержкой в каждом в течение 15 минут. Для просветления их последовательно погружают в две емкости с промежуточными смесями, в каждую на 30 минут, а затем в минеральное масло на 30 минут. Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в двух порциях по 15 минут. Общее время проводки без учета фиксации 2 часа 30 минут.

Оба расписания пригодны для использования как при ручной проводке, так и для использования в процессорах карусельного и вакуумного типа.

Способ иллюстрируется примерами.

Ручная проводка образца ткани молочной железы, размером 1,5×1,5×0.3 см.

1. 10% формалин, забуференный фосфатами, 24 часа, комнатная температура, 24 часа. Соотношение фиксатор: ткань не менее 20:1.

2. Промывка в проточной воде 20-30 минут.

3. 70% изопропанол 1 час.

4. 80% изопропанол 1 час.

5. 95% изопропанол 1 час.

6. 99.7% изопропанол 1 час.

7. 99.7% изопропанол 1 час.

8. Промежуточная смесь I, 1.5 часа.

9. Промежуточная смесь II, 1.5 часа.

10. Минеральное масло 1.5 часа.

11. Парафин, 60°С, 1 час.

12. Парафин, 60°С, 1 час.

13. Парафин, 60°С, 1 час.

14. Парафин, 60°С, 1 час.

Заливка в парафин.

Ручная проводка образца ткани желудка, размером 0,1×0,1×0,1 см.

1. 10% формалин, забуференный фосфатами, 24 часа, комнатная температура, 24 часа. Соотношение фиксатор: ткань не менее 20:1.

2. Промывка в проточной воде 5 минут.

3. 70% изопропанол 15 минут.

4. 99.7% изопропанол 15 минут.

5. Промежуточная смесь I, 30 минут.

6. Промежуточная смесь II, 30 минут.

7. Минеральное масло 30 минут.

8. Парафин, 60°С, 30 минут.

9. Парафин, 60°С, 30 минут.

Заливка в парафин.

Описанные средства и методы, с помощью которых возможно осуществление способа подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, с реализацией указанного назначения, подтверждает соответствие заявленного изобретения условию патентоспособности — промышленная применимость.

1. Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, включающий последовательную обработку образцов биологической ткани раствором фиксатора, промывку в воде, дегидратацию в нескольких порциях изопропанола, просветление в двух порциях промежуточных смесей, содержащих изопропанол и минеральное масло, просветление в минеральном масле, пропитывание и заливку образцов парафином, отличающийся тем, что в качестве фиксатора используют 10%-ный раствор формалина, забуференного фосфатами натрия, обработку в промежуточных смесях ведут при комнатной температуре, при этом первая порция промежуточной смеси содержит пять частей изопропанола и одну часть минерального масла, а вторая порция содержит две части изопропанола и одну часть минерального масла, образцы биологических тканей пропитывают расплавленным парафином, в который добавляют 5% пчелиного воска, 0,8% диметилсульфоксида и 0,5% бутилкаучука.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в фиксатор для эндоскопических образцов биологических тканей добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован эозин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в фиксатор для хирургических образцов биологических тканей добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован метиленовый синий.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в изопропанол и промежуточные смеси добавляют поверхностно-активное вещество, в качестве которого использован Triton X15.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы биологических тканей выдерживают в минеральном масле в качестве просветлителя по меньшей мере 2 ч.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°C в течение 4 ч, при этом в двух емкостях по 2 ч или в 4 емкостях по 1 ч.

Источник

Авто портал
Adblock
detector